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【抗體】——如何做出漂亮WB圖片

概要

WB(Western Blot)實驗是定性、定量檢測蛋白表達的一種經典、有效的技術方法。WB的優點是靈敏,可達ng級別,用ECL顯色法可達pg級別,方便,特異性高

WB(Western Blot)實驗是定性、定量檢測蛋白表達的一種經典、有效的技術方法。WB的優點是靈敏,可達ng級別,用ECL顯色法可達pg級別,方便,特異性高,但是WB實驗步驟繁多,操作復雜,許多朋友在做WB實驗時吐槽總會遇上這樣那樣的問題:WB檢測信號弱、檢測不到條帶、有非特異條帶、背景深等等,導致無法獲得想要的WB圖片。對此:預防為主,嚴格按要求做好每一步。下面根據我們實驗的經驗為大家整理了常見的WB實驗問題以及相應處理方法,希望能幫助大家獲得想要的漂亮WB圖片結果,如有補充,歡迎留言。

01?無條帶

1.??抗體不夠。抗體對目標蛋白的親和力可能較低或活性降低,建議增加抗體濃度(比建議的起始濃度高2-4倍)。也可能是抗體失去活性,需要換新的抗體。

2.??樣本中蛋白含量低。建議使用陽性對照樣本確定實驗的有效性,提高蛋白上樣量,用其他方法確定樣本中目的蛋白的存在。

3.??轉膜失敗。確保NC或者PVDF膜與凝膠之間有良好的接觸。

4.??轉膜不完全。建議優化轉膜時間,高分子量蛋白需要更長時間。為了保證轉膜完全,建議用麗春紅,酰氨黑,印度墨水染膜。或使用預染marker。

5.??轉膜轉過了。降低低分子量蛋白質(< 10 kDa)的轉移電壓或時間。

6.??蛋白等電點大于9。建議使用pH值較高的替代緩沖系統,如CAPS (pH 10.5)。

7.??二抗使用錯誤。確認二抗的宿主和亞型。

8.??抗體過期。建議更換新鮮抗體。

9.??抗體儲存不當。按照供應商建議儲存,避免反復凍融。

10.疊氮化鈉污染。確保緩沖液不含疊氮化鈉,因為疊氮化鈉會抑制HRP信號。

11.抗體孵育時間不夠。建議4℃過夜孵育一抗。

02?條帶弱

1.??蛋白和抗體結合較弱。建議減少洗滌次數,降低抗體稀釋液和洗液中的NaCl濃度(推薦范圍為0.15M - 0.5M)。

2.??抗體不夠。抗體對目標蛋白的親和力可能較低或活性降低,建議增加抗體濃度(比建議的起始濃度高2-4倍)

3.??蛋白量不夠。建議提高樣本上樣量。

4.??偶聯物活性降低。建議把酶和底物在一個管子中混合,如果沒有顯色或者很弱,需要更換新的試劑做實驗。

5.??ECL試劑失效,建議更換新的ECL試劑。

6.??脫脂奶粉可能會封閉一部分抗原。建議降低封閉液和抗體稀釋液中奶粉的含量或者用3%BSA代替。

03?多條帶

1.??一抗的非特異結合。建議降低一抗濃度,減少蛋白上樣量,或者更換特異性更高的單抗。

2.??二抗的非特異結合。不加一抗,僅用二抗做對照,如果出現條帶就選擇其他二抗。

3.??一抗或二抗的非特異結合。建議在一抗或二抗溶液中加入0.1 - 0.5% Tween20,提高洗液Tween20含量(0.1%-0.5%),增加洗膜次數,提高抗體稀釋液和洗液中的NaCl濃度(0.15M - 0.5M)。

4.??蛋白的聚集。建議增加DTT用量(20 -100mM DTT),保證二硫鍵完全還原。上樣前在沸水中加熱5-10分鐘,并進行短暫的離心。

5.??蛋白的降解。建議避免樣本的反復凍融,樣本儲存前加入蛋白酶抑制劑或者使用新鮮樣本。

6.??試劑污染。檢查緩沖液中是否有微粒或細菌污染,使用新鮮的試劑。

04?高背景

1.??一抗的非特異結合。建議降低一抗濃度,用5%優質脫脂牛奶封閉,調整一抗溶液中脫脂奶粉含量(2%-5%)或者NaCl濃度(0.15M - 0.5M),或者更換特異性更高的單抗。

2.??二抗的非特異結合。不加一抗,僅用二抗做對照,如果出現條帶就選擇其他二抗。

3.??封閉不完全。在含有5%脫脂奶粉的封閉液中加入0.1%- 0.5% Tween 20,適當延長封閉時間。4℃封閉過夜可能降低封閉效果。

4.??脫脂奶粉可能會封閉一部分抗原。建議用3%BSA代替。

5.??脫脂奶粉含有內源性生物素,與親和素/鏈霉親和素不相容。建議用3%BSA代替。

6.??一些抗體可以識別牛奶蛋白。建議用3%BSA代替。

7.??洗膜不充分。建議增加洗滌次數,提高洗液Tween20含量(0.1%-0.5%)。

8.??膠片曝光過度。建議降低曝光時間,如果目標信號太強,等待5-10分鐘,重新曝光到膠片上。

05?白色條帶

  1. 過度的信號生成。建議降低抗體或蛋白濃度,過量的抗體或蛋白可引起極高水平的局部信號(通常是一條帶)。這導致在這一點上底物的快速、完全消耗,由于這個反應完成后沒有光產生,所以當暴露在膠片上時,就會產生白色的條帶。

  2. ECL顯色劑過于靈敏,或者發光時間太短。建議更換低靈敏度的ECL顯色劑。


06?出現斑駁不平的斑點

1.??試劑的污染。檢查緩沖液中是否有微粒或細菌污染,使用新鮮的試劑。

2.??孵育或洗滌的溶液不夠。確保膜完全浸泡到洗液或孵育液中。

3.??在膜中有氣泡。輕輕去除所有氣泡。特別是在轉膜過程中。

4.??孵育過程中攪拌不均勻。通過放置在搖動器上確保攪拌均勻。

5.??設備污染。確保電泳裝置正確清洗。殘留的蛋白質或凝膠碎片可能會粘附在膜上,徹底洗膜。

6.??曝光過度。建議減少曝光時間。


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